食物清静不断受到普遍关注，滚环在实现食物中传染物精确检出的扩增条件下，快捷利便的技术检测检测方式对于食物清静的坚持具备紧张事实意思。滚环扩增技术(rolling circle amplification，食物 RCA)睁开于20世纪90年月中期，清静是中的钻研一种重大高效的体外核酸扩增技术，可在等温的妨碍条件下快捷扩增出由模板互补序列串联而患上的长单链DNA。由于其引物易于标志牢靠以及其模板妄想多样性，滚环RCA运用于生物传感器中以及在后退传感器的扩增检测锐敏度方面具备清晰优势，因此被普遍运用于医疗诊断、技术检测情景监测以及食物清静等生物技术规模的食物钻研中。本文综述了近多少年RCA技术在食源性致病微生物、清静生物毒素、中的钻研农药兽药残留、妨碍重金属等食物清静危害因子检测中的滚环钻研与运用妨碍，并展望了该技术在食物清静检测规模的睁开倾向。
引言
食物在破费加工的各个关键中都可能受到传染物的影响，临时摄入有清静隐患的食物会对于人体瘦弱发生倒霉影响。将食物中有毒有害传染物精确、快捷、利便地检出是迷信实用地处置被传染食物的需要条件。核酸的体外扩增经由30多年的睁开，已经成为性命迷信睁开中一种不可或者缺的紧张技术。聚合酶链式反映(polymerase chain reaction，PCR)是当初普遍运用的核酸体外扩增措施，但有依赖热循环步骤，可能会对于某些紧张生物份子发生破损而且有利于试验室外实施。睁开于20世纪90年月初的等温扩增技术可实用地实现核酸序列的快捷积攒，这种扩增技术凭证第一步反映的特色，可被分为两大类：一类依赖于特异性引物缩短，搜罗环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依赖核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)以及依赖解旋酶扩增技术(helicase-dependent amplification，HAD)等；另一类是依赖于限度性内切酶，搜罗链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)、暗语酶扩增反映(nicking enzyme amplification，NEAR)以及切刻内切酶介导扩增技术(nicking enzyme mediated amplification，NEMA)等。其中RCA具备多项合勤勉用。首先，RCA产物由大批的具备高度可操作性的一再序列组成，扩增模板的多样妄想可能实现多种运用目的，好比扩增核酸适配体、DNA模拟酶等功能核酸以及信号探针互补位点、限度性酶位点等。
此外，经由引物序列的修饰概况妄想，可将RCA扩增产物直接牢靠于试条纸、微孔板、微流控芯片以及纳米颗粒等载体上，概况衔接在核酸适配体、卵白质等生物大份子上，这使RCA可锐敏地与其余分说检测技术相散漫。RCA技术在原位检测、微量物资测定、核酸诊断、单碱基多态性以及药物研发等钻研以及份子诊断中有大批的相关钻研报道并已经有商业化产物泛起。好比，上海易色医疗破费的“一步法恒温支原体检测试剂盒”其锐敏度高于艰深PCR(30 cycles)80倍；华大基因经由运用美国Complete Genomics公司基于RCA开拓的DNA纳米球基因测序技术，宣告了桌面化测序零星BGISEQ-500，其基因组检测精度可达99.99%。图1对于1995年以来每一年宣告的RCA相关文献数目妨碍了统计，2014年以来，RCA相关文献总量以每一年200余篇的数目削减，标明了RCA技术的运用钻研后劲以及迷信界对于其的不断关注。当初，已经有文献对于RCA在医疗诊断、生物检测等规模妨碍了回顾，但未见其在食物清静方面运用的综述。因此，本文从RCA技术的道理以及特色动身，重点演绎总结了近些年来RCA技术在食物清静检测中的运用，零星梳理了其钻研运用阶段性下场，以期拓宽该技术在食物清静隐患的快捷筛查的运用睁开。
1 RCA技术简介
1.1 RCA技术道理
RCA技术是对于做作界中的某些转座子、质粒以及病毒基因组的滚环复制的模拟而提出的。20世纪90年月中期，美国卡内基钻研所的FIRE团队以及斯坦福大学的Kool团队先后形貌了RCA。艰深地，RCA可分为模板的衔接成环以及滚环扩增两部份。以罕用的锁式探针模板(padlock probe，PLP)为例，PLP长度在100 bp之内，主要由两部份组成：(1)与引物反向互补的5'-磷酸化检测臂(T1)以及3'-检测臂(T2)；(2)功能地域Zip，位于T1以及T2之间，为RCA产物中的功能性序列提供模板。如图2a所示，在衔接成环时，退火后的PLP与初始引物杂交，T1与T2相邻而组成的裂口在DNA衔接酶的熏染下闭合天生环状DNA模板。扩增步骤由具备连置换性的DNA聚合酶介导，图2b揭示了典型的线性RCA(linear rolling circle amplification，LRCA)的扩匆匆历程，在恒定温度下，DNA聚合酶将d NTPs削减到扩增引物5'端。当产物链在模板上缩短一周后，由于酶的链置换性，已经扩增出的产物链的脱氧核糖核苷酸挨次从模板上被置换，以妨碍下一个核苷酸的缩短。RCA的扩匆匆历程彷佛拉出一卷卷尺，因此最终的RCA扩增产物是一个由含数百至数千个一再序列单体串联而组成的长ss DNA。
1.2 RCA技术特色
RCA具备高度锐敏性以及特异性。在一个靶标份子对于应一个引物的RCA生物传感器中，实际上可能实现1个拷贝的锐敏度。RCA反映条件以及善，仪看重大，在罕有的恒温仪器(如水浴、恒温哺育箱)中即可妨碍扩增。RCA扩增的最适温度挨近心理温度，以及善的反映条件使RCA致使可能在生物体中妨碍。RCA具备高效的扩增能耐以及信号淘汰能耐。钻研发现，Phi29 DNA聚合酶退出的LRCA可能发妨碍达105个碱基长度的扩增产物；运用2个扩增引物的超支化滚环扩增(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)可在90 min内发生109的信号淘汰下场。为进一步实现RCA的信号淘汰，运用多个扩增引物的多引物RCA(multiple primers rolling circle amplification，MRCA)已经在近些年被运用。而在已经报道的运用中，基于RCA信号淘汰的生物传感器个别可对于pmol/L致使amol/L级浓度的靶标物妨碍检测。另一方面，差距于PCR对于低品貌被检核酸的扩增，RCA扩增的是靶向妄想的核酸序列，妄想的模板多样性抉择了扩增方式以及扩增产物的多样性，因此，RCA运用于传感器中可实现多种信号方式的淘汰。
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